轉(zhuǎn)染試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟

 　　轉(zhuǎn)染試劑盒可用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞包括各種細(xì)胞株和原代細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞，成肌細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞，上皮細(xì)胞等等。轉(zhuǎn)染試劑盒都經(jīng)無菌處理，并通過嚴(yán)格質(zhì)量檢驗(yàn)，可以直接使用。轉(zhuǎn)染試劑盒可在室溫(15～25℃)保存三個月，4℃保存一年，-20℃保存一年以上。

　　轉(zhuǎn)染試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟：

　　1. 使用前預(yù)熱試劑至常溫。

　　2. 轉(zhuǎn)染前一天，接種適量細(xì)胞懸液至100-mm培養(yǎng)皿、60-mm培養(yǎng)皿或6孔板中，放置到潮濕37°C 5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。

　　3. 次日，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液。

　　4. 取兩根無菌1.5ml eppendorf管，分別記為A、B。按下表，根據(jù)培養(yǎng)皿不同而加入不同體積的試劑：

　　5. 用移液管混勻B管中溶液并將B管中溶液輕輕逐滴加入到A管中。用氣泡法混勻轉(zhuǎn)染混合物，這一步盡量在2分鐘內(nèi)完成，室溫孵育30分鐘。

　　6. 將混合物逐滴加入到細(xì)胞中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿使混合物均勻分布在細(xì)胞表面。

　　7. 放置到潮濕37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

　　8. 次日早上用新鮮培養(yǎng)基更換細(xì)胞培養(yǎng)液，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。

　　9. 檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率(如熒光觀察，蛋白質(zhì)印跡等)。

　　轉(zhuǎn)染試劑盒使用注意事項(xiàng)：

　　轉(zhuǎn)染前以細(xì)胞融合度不超過80%為宜，接種密度因所采用的細(xì)胞系和細(xì)胞的倍增時間而有所不同。

　　高純度的質(zhì)粒是獲得高轉(zhuǎn)染效率的必要條件，要確保A260/A280大于1.8，并且電泳檢測抽提到的質(zhì)粒90%以上都是超螺旋。

　　轉(zhuǎn)染時，B管中溶液輕輕逐滴加入到A管中，請勿混亂順序。

　　溶液的pH值關(guān)系到轉(zhuǎn)染效率，盡量避免把轉(zhuǎn)染試劑盒的溶液長時間暴露在空氣中，以免被空氣中的二氧化碳酸化。

　　轉(zhuǎn)染時由于質(zhì)粒不同、細(xì)胞不同，*的質(zhì)粒用量需自行摸索。

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