細胞轉(zhuǎn)染實驗質(zhì)量控制貼士

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細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術(shù)。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學試驗中，其應用越來越廣泛。影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多,細胞株本身的特性和活性，細胞培養(yǎng)條件,轉(zhuǎn)染的DNA或RNA的質(zhì)量，轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染試劑的選擇等。
轉(zhuǎn)染效率受多種因素影響，主要因素有下面幾個:
1．轉(zhuǎn)染試劑
不同細胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細胞系的選擇通常是根據(jù)實驗的需要，因此在轉(zhuǎn)染實驗前應根據(jù)實驗要求和細胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。當然，zui shi he的是高效、低毒、方便、廉價的轉(zhuǎn)染試劑。
2．細胞狀態(tài)
一般低的細胞代數(shù)（<50）能確保基因型不變。zui shi he轉(zhuǎn)染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到指數(shù)生長期的細胞，細胞生長旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。
3．轉(zhuǎn)染方法
轉(zhuǎn)染時應跟據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法，但也要注意，因不同實驗室培養(yǎng)的細胞性質(zhì)不同，質(zhì)粒定量差異，操作手法上的差異等，其轉(zhuǎn)染效果可能不同，應根據(jù)實驗室的具體條件來確定最佳轉(zhuǎn)染條件。
(1）細胞培養(yǎng)物
不同細胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細胞密度，一般的轉(zhuǎn)染試劑都會有專門的說明。推薦在轉(zhuǎn)染前24小時分細胞，這將提供正常細胞代謝，增加對外源DNA攝入的可能。一定要避免細菌，支原體或真菌的污染。
(2）細胞密度
不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時的最適細胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會因不同的細胞類型或應用而異。因此如果選用新的細胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進行優(yōu)化實驗并為以后的實驗建立一個穩(wěn)定方法,包括適當?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等等。陽離子脂質(zhì)體具有微量的細胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細胞數(shù)，有的要求細胞90%匯片;而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%-80%之間，總之是盡導致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。
(3）血清
轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，如陽離子聚合物等，血清的存在會影響DNA一轉(zhuǎn)染復合物的形成,但只要在DNA-轉(zhuǎn)染復合物形成時用無血清培養(yǎng)基或PBS來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就可以了，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。不過要特別注意:對于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。胎牛血清（FCS）經(jīng)常用到，便宜一點的有馬或牛血清。
(4）抗生素
目前轉(zhuǎn)染試劑因為全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的*培養(yǎng)基來操作，非常方便，省去了污染等麻煩。
(5)氮磷（N/P)比
N/P比是轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵（為了換算方便，一般以DNA/轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量比表示)，在一定比例范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率隨N/P比成比例增高，之后達到平值，但毒性也隨之而增加，因此在實驗之前應根據(jù)推薦比例，確定本實驗的轉(zhuǎn)染比例。
(6）DNA質(zhì)量
DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)(如脂質(zhì)體等)基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行。
4．載體構(gòu)建
轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒.DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染)。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進行，因此選擇組成或可調(diào)控，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對照可排除毒性影響的干擾。

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