ALL SEQ-Low-Level DNA Detection

Low-Level DNA Detection

1.smMIP

單分子分子反轉探針

smMIP方法使用單分子標記和分子反轉探針來檢測和量化低頻率發生的遺傳變異 （Hiatt等，2013）。在該方法中，探針用于檢測gDNA中的靶標。在復制探測的靶標后，外切核酸酶消化使標記物離開靶標，隨后進行PCR擴增。測序允許靶標的高分辨率序列讀取，而更大的深度允許更好地比對每個*的分子標簽。

好處：

檢測低頻目標

可以對原料有限的樣品進行單細胞測序或測序

臨床樣本中 每堿基誤差為2.6×10 -5 （Eboreime等，2016）

缺點：

PCR擴增錯誤

PCR偏差可以代表富含GC的模板

在PCR期間，聚合酶優先擴增小于500bp的靶標

2.MIPSTR

smMIPs有針對性地捕獲STR基因座

MIPSTR是一種對許多個體的種系和體細胞短串聯重復（STR）變異進行多重基因分型的方法（Carlson等，2015）。該方法是smMIP （Hiatt等，2013） 方法的變體， 并使用新穎的映射策略。

該方法使用具有共同主鏈的smMIP用于PCR引物，測序銜接子，12bp簡并標簽和具有基因座特異性和STR側翼序列的靶向臂。捕獲遺傳多樣性的個體可識別種系STR變異。使用簡并標簽識別技術變異，并且跨標簽定義的讀取組的STR變化被認為是體細胞變異。

好處：

能夠區分技術錯誤與體細胞STR突變

缺點：

需要高質量的參考基因組

3.MDA

多位移放大

MDA是一種常用于測序微生物基因組的方法，因為它能夠擴增大于0.5 Mbp的模板，但它也可用于研究其他大小的基因組 （Dean et al。，2001）。在該方法中，3'封閉的隨機六聚體引物與模板雜交，然后用Phi 29聚合酶進行鏈置換DNA合成。該方法允許有效和快速的DNA擴增。擴增DNA的深度測序提供了讀數的準確表示，而測序深度為序列提供了更好的比對和共識。原始MDA方法的幾種變體，如MIDAS （Gole等，2013），ddMDA （Rhee等，2016），SNES （Leung等，2015）和IMS-MDA。（Seth-Smith等，2013）已經開發出來以改善擴增偏差和通量 （Seth-Smith等，2013）。

好處：

模板可以是環狀DNA（例如，質粒，細菌DNA）

可以對大模板進行排序

可以對有*原料的樣品進行單細胞測序或測序

缺點：

強放大偏差; 基因組覆蓋率低至約6％ （Navin et al。，2011）

PCR偏差可以代表富含GC的模板

受污染的試劑會影響結果 （Woyke等，2011）

4.MALBAC

多次退火和循環放大的放大周期

MALBAC旨在解決MDA的一些缺點 （Zong等，2012）。在該方法中，MALBAC引物隨機退火至DNA模板。在升高的溫度下具有置換活性的聚合酶擴增模板，產生半胱氨酸。“隨著擴增和退火過程的重復，半胱氨酸擴增成全擴增子，其末端與5'末端互補。結果，全擴增子末端雜交形成環狀結構，抑制環狀擴增子的進一步擴增，而只有半縮樣子和gDNA經歷擴增。全擴增子序列的深度測序允許準確表示讀數，而測序深度為共有序列提供改進的比對。該方法也可以應用于cDNA用于轉錄組分析 （Briese等，2016）。

好處：

可以對大模板進行排序

可以對有*原料的樣品進行單細胞測序或測序

全擴增子環化抑制模板的過度表達，減少PCR偏倚

可以擴增富含GC的區域

提供統一的基因組覆蓋

與MDA相比，等位基因丟失率較低

缺點：

與Phi 29相比，聚合酶相對容易出錯 （Gole et al。，2013）

溫度敏感協議

提供高達約90％的基因組覆蓋率 （Lovett等，2013），但基因組的某些區域的代表性不足（Lasken等，2013）

5.NUC-SEQ / SNES

S期/單核外顯子組測序中細胞的單個G2 / M核測序

修改的MDA方案nuc-seq利用了細胞周期的G2_M階段中的單個細胞具有4個拷貝的基因組的事實。該特性允許細胞用細胞分選儀分離，并且它還顯著增加單細胞的基因組覆蓋度 （Wang等人，2014）。SNES是一種額外的變異，包括外顯子組的靶向選擇和測序 （Leung等，2015）。Div-Seq是一種變體，它將nuc-seq與5-乙炔基-2_-脫氧尿苷（EdU）的增殖細胞脈沖標記相結合， Habib等，2016）

好處：

nuc-seq：將單細胞測序的物理覆蓋性能提高到90％以上

SNES：單細胞中外顯子組覆蓋率為95.94％

SNES：同基因群體中SNV的檢測效率為92.37％

缺點：

nuc-seq：不適用于低增殖率的細胞

SNES：限于外顯子組

6.OS-Seq

寡核苷酸選擇性測序

開發OS-Seq是為了通過直接在流動細胞上捕獲和測序基因靶標來改進靶向重測序 （Myllykangas等，2011）。在該方法中，使用具有銜接子的靶序列來修飾流動細胞引物。使用修飾的引物將模板中的靶標捕獲到流動池上。進一步延伸，變性和雜交提供靶基因的序列讀數。深度測序提供準確的讀數表示。

好處：

可以一次重新排序多個目標

無需凝膠切除或窄尺寸純化

快速，單日協議

樣品可以多路復用

由于去除了擴增步驟，降低了PCR偏差

避免材料損失

缺點：

引物可以與相似的靶序列相互作用，導致序列模糊

7.Duplex-Seq

雙工序列

Duplex-Seq是一種基于標簽的糾錯方法，可提高測序準確度 （Schmitt等，2012）。在該方法中，將銜接子（具有引物序列和隨機的12bp索引）連接到模板上并使用PCR擴增。深度測序提供來自每個*分子標簽的共有序列信息。基于分子標簽和測序引物，對齊雙鏈體序列，確定每條DNA鏈上的真實序列。估計該方法比傳統NGS準確度高10,000倍 （Ahn等，2015）。雙重測序的目標版本包括2輪捕獲，讀取深度高達1,000,000x （Schmitt等，2015）

好處：

可以檢測> 10 7個測序核苷酸中的單點突變（Schmitt等，2012），（Schmitt等，2015）

雙工標記導致錯誤率極低

可以檢測PCR擴增錯誤并從分析中除去

添加適配器后無需額外的文庫準備步驟

缺點：

復雜的文庫構建（Stahlberg et al。，2016）