Rubicon WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴增試劑盒說明書

A 產(chǎn)品組成—PicoPLEX WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴增試劑盒

試劑量可供50次反應(yīng)。

B PicoPLEX WGA Kit儲存與處理

-20℃儲存。

使用前，細(xì)胞提取酶、預(yù)擴增酶和擴增酶組份放到冰上。其他組份使用前在冰上解凍并且稍微漩渦振蕩（vortex and quick-spin）。

試劑儲存、處理和反應(yīng)設(shè)置都要遵守實驗室PCR操作規(guī)范。

C單細(xì)胞全基因組擴增試劑盒其他準(zhǔn)備材料

熱循環(huán)儀（PCR儀，推薦使用實時PCR儀）

PCR管或96孔PCR板

低吸附吸頭（Low-binding barrier tips）

磷酸鹽緩沖液（PBS）

D PicoPLEX WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴增試劑盒產(chǎn)品描述

單管，3步，PicoPlEX WGA試劑盒專門用于人單細(xì)胞和pg級DNA的擴增，具有可重復(fù)性、低背景的特點。3小時內(nèi)完成細(xì)胞裂解、熱循環(huán)文庫制備和低背景擴增，zui終能得到2-5µg擴增DNA。

PicoPLEX單細(xì)胞全基因組擴增流程

細(xì)胞+裂解/提取緩沖液，15min ——預(yù)擴增混合液，90min ——擴增混合液，30min ——分析

PicoPLEX WGA Kit適用樣本

1.1-10個人細(xì)胞，如：囊胚細(xì)胞、極體、滋胚層細(xì)胞、羊水細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等。

2.1000-10000個細(xì)菌細(xì)胞

3.分離DNA（15pg-50pg人DNA）

4.分選染色體（Sorted Chromosomes ）

5.不完整或片段化，單/雙鏈DNA

6.樣本zui大體積：5µL

E PicoPLEX WGA全基因組擴增產(chǎn)物應(yīng)用

拷貝數(shù)變異（CNV）分析，基于oligonucleotide aCGH, BAC aCGH, or qPCR

SNP 基因表型

突變檢測

F PicoPLEX單細(xì)胞全基因組擴增細(xì)胞樣本采集

細(xì)胞采集方法

兼容PicoPLEX WGA Kit的正確細(xì)胞采集方法有流式分選術(shù)，稀釋和顯微操作。細(xì)胞染色后可能會對試劑盒性能造成不好影響。為了得到*結(jié)果，一定要避免使用福爾馬林固定法。

細(xì)胞洗滌

細(xì)胞樣本制備時強烈推薦用PBS洗滌，以盡量減少非細(xì)胞DNA污染。選擇不含鎂、鈣、BSA的PBS。zui終細(xì)胞樣本中所含PBS體積不能超過2.5µL。

G 使用擴增后的對照DNA作為參照

DNA對照樣本對于某些如微陣列和qPCR平臺有參照價值。為了得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，強烈推薦PicoPLEX擴增樣本的對照選擇PicoPLEX擴增后的DNA對照而不是沒有擴增的DNA對照。

DNA對照樣本按樣本配制方法（J）配制，按PicoPLEX操作步驟（K）擴增。Pooling DNA對照的擴增反應(yīng)的產(chǎn)物可以得到*結(jié)果。

H PicoPLEX WGA全基因組擴增產(chǎn)物純化和定量

WGA單細(xì)胞全基因組擴增產(chǎn)物用于下游時，許多應(yīng)用使用前需要純化和定量。純化方法可以使用 spin columns或過濾板。

產(chǎn)物定量使用紫外吸光度法（UV absorbance ，1 OD260 = 50 µg/mL）。PicoGreen™或其他雙鏈DNA定量法所得PicoPLEX產(chǎn)物密度可能不可靠。

純化后的PicoPLEX擴增產(chǎn)物-20 °C儲存。

I 選擇合適的反應(yīng)管/反應(yīng)板

PicoPLEX操作指南的步驟7中，如果孵育時PCR管/板密封性不夠，會造成大量（>5 µL）的試劑蒸發(fā)，zui終影響PicoPLEX WGA結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

步驟7也可以加15 µL 水，無視所選反應(yīng)管/板密封性能否盡量減少蒸發(fā)造成的體積損失。（A mock PicoPLEX Protocol Step 6 incubation using 15 µL of water is advised to confirm whether a selected tube or plate/seal combination can be used with minimal volume loss due to evaporation.）

J樣本配制方法

5µL細(xì)胞樣本

1.依照F所述方法用PBS稀釋或淋洗細(xì)胞。

2.如果采用流式分選采集細(xì)胞：

單個細(xì)胞加入含5 µL細(xì)胞提取緩沖液（綠蓋）的PCR管/孔。

如果采用顯微操作或稀釋法：

單個細(xì)胞先用zui少PBS（<2.5 µL)）混合，再加入含適量細(xì)胞提取緩沖液（綠蓋）的PCR管/孔，zui終樣本體積5 µL。

1. 配制好的細(xì)胞立即 -80 °C 凍存或直接進行擴增操作。

5µL DNA樣品（單細(xì)胞simulation）

1.配制1 ng/µL 純化DNA溶液：PCR管/孔中，5 mM Tris-HCl (pH8.0)稀釋對照DNA。

2.漩渦振蕩30s。

3.配制15 pg/µL DNA溶液：3µL 1 ng/µL DNA溶液+197 µL 5 mM Tris-HCl (pH 8.0)。

4.漩渦振蕩30s。

5.PCR管/孔中，1 µL 15 pg/µL DNA溶液+ 4 µL 細(xì)胞提取緩沖液（綠蓋）。

K PicoPLEX操作步驟

細(xì)胞提取

1.添加提取混合液各組份并充分混勻。

2.每5µL細(xì)胞樣本或DNA樣本（J部分配制）加5 µL新鮮配制的提取混合液。

3.按下表在熱循環(huán)儀中孵育樣本：

4.試管/板稍微離心。

預(yù)擴增

5.添加預(yù)擴增混合液各組份并充分混勻。

6.每個細(xì)胞樣本/DNA樣本加5µL預(yù)擴增混合液。

7.按下表在熱循環(huán)儀中孵育樣本：

8.稍微離心，預(yù)擴增孵育產(chǎn)物放到冰上。

擴增

9.添加擴增混合液各組份并充分混勻。

注意：樣本擴增效率可以通過在擴增混合液中添加SYBR Green I dye（zui終密度：0.125x）進行實時PCR儀分析。一些儀器需要額外添加其他染色劑做信號歸一化（signal normalization）。

10. 新鮮配制的擴增混合液取60 µL和15 µL預(yù)擴增孵育產(chǎn)物混合，吸管混勻。

11.按下表在熱循環(huán)儀中擴增樣本：

注意：基于Rubicon用流式分選培養(yǎng)細(xì)胞的測試，推薦14 cycles。一些細(xì)胞類型要獲得zui高產(chǎn)量，可能需要更多cycles（zui高達(dá)16 cycles）。

12.PicoPLEX 擴增產(chǎn)物立即 -20 °C儲存或用于下游純化（見H）。

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RB3050 Rubicon PicoPLEX WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴增試劑盒

從單細(xì)胞中擴增DNA構(gòu)建高重復(fù)性的文庫現(xiàn)在成為可能。PicoPLEX WGA kit采用技術(shù)，設(shè)計、優(yōu)化用于從單細(xì)胞中擴增單拷貝基因組DNA。起始量低至單細(xì)胞或6pg基因組DNA。便捷的單管操作流程減少失誤，節(jié)省時間并降低反應(yīng)背景。

PicoPLEX WGA Kit兼容微陣列比較基因組雜交（array CGH）分析及PCR平臺，被試管嬰兒行業(yè)供應(yīng)商如BlueGnome信賴并用于PGS/PGD。

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